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日期:2023-07-12瀏覽:419次
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNMT3B)真核蛋白操作步驟:
Ⅰ 實(shí)體組織蛋白的提取
1. 在每1mL 冷Lysis Buffer加入10 μL磷酸酶抑制劑, 1 μL蛋白酶抑制劑和 5μL 100mM PMSF,混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用。
2. 每100mg固體組織置于培養(yǎng)皿中,剪碎成3mm×3mm左右的小塊,加入0.5~1 mL冷 Lysis Buffer,玻璃勻漿器上下手動(dòng)勻漿15次,注意低溫操作;
3. 取組織勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5mL預(yù)冷的離心管,離心10000轉(zhuǎn)/分,4℃離心5 min;
4. 取上清轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷的離心管中,即為全蛋白提取物,蛋白定量(Bradford法、BCA法);
5. 分裝保存于-70℃,避免反復(fù)凍融。
Ⅱ 培養(yǎng)細(xì)胞蛋白提取
1. 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞,吸去培養(yǎng)基后,加入10mL/150mm培養(yǎng)板的冷PBS洗兩次,每次振搖數(shù)次以盡量去除培養(yǎng)液;
2. 懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞或用細(xì)胞刮子刮下的貼壁細(xì)胞,將細(xì)胞及培養(yǎng)液移至離心管中, 1000轉(zhuǎn)/分離心10 min,再用10mL/150mm培養(yǎng)板的冷PBS,1000轉(zhuǎn)/分離心5 min洗兩次;
3. 在每 1mL冷 Lysis Buffer加入10μL磷酸酶抑制劑, 1μL蛋白酶抑制劑和5μL 100mM PMSF,混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用。
4. 細(xì)胞洗滌后,轉(zhuǎn)至新的預(yù)冷的離心管中,加入上述配制好的冷Lysis Buffer,加入量如下表所示:
細(xì)胞數(shù)量
Lysis Buffer加入量
107個(gè)
0.5 mL~1 mL
5×106個(gè)
0.2 mL~0.5 mL
5.置于4℃搖床平臺(tái)上,溫和振蕩15 min;
6. 14,000rpm,4℃離心15min,取上清為全蛋白提取物, 蛋白定量(Bradford法、BCA法);
7. 分裝保存于-70℃,避免反復(fù)凍融
DNA堿性膠上樣液(1.5 mL)
DNA堿性膠上樣液(10 mL)
DNA尿素-PAGE上樣液(1.5 mL)
DNA尿素-PAGE上樣液(10 mL)
DNA上樣液(紅),6×(非甘油)(見(jiàn)關(guān)聯(lián)產(chǎn)品)
DNA上樣液(藍(lán)),6×(非甘油)(見(jiàn)關(guān)聯(lián)產(chǎn)品)
DNA上樣液,6×(紅)
DNA上樣液,6×(藍(lán))
miRNA尿素-PAGE上樣液(1.5 mL)
miRNA尿素-PAGE上樣液(10 mL)
三合一RNA上樣液(A型)
三合一RNA上樣液(B型)
核酸染料
SYBR Green Ⅱ核酸染料
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電泳級(jí)耐熱型SYBR染料
綠如藍(lán)核酸染料(UV)(0.5 mL)
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綠如藍(lán)核酸染料(可見(jiàn)光型)
溴化乙錠干粉
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溴化乙錠溶液(1.5 mL)