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超純RNA提取試劑盒(DNase I)操作步驟

日期:2022-06-08瀏覽:1158次

超純RNA提取試劑盒(DNase I)操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞,每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml,用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定,不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c.細胞懸液 離心收集細胞,每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol,反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2.將勻漿樣品在室溫(15-30℃)放置5分鐘,使核酸蛋白復合物*分離。

3.可選步驟:如樣品中含有較多蛋白質(zhì),脂肪,多糖或胞外物質(zhì)(肌肉,植物結(jié)節(jié)部分等)可于2-8℃10000×g離心10分鐘,取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。處理脂肪組織時,上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,劇烈振蕩15秒,室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層:底層為黃色有機相,上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中,水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中,如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相,進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇,室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘,離心前看不出RNA沉淀,離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

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