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文氏密螺旋體探針法熒光定量PCR試劑盒使用流程

日期:2020-11-25瀏覽:955次

文氏密螺旋體探針法熒光定量PCR試劑盒使用流程:

一、稀釋PCR陽性對(duì)照(以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例)

1. 注意:由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照,只提供可以直接使用的DNA段作為陽性對(duì)照。

2. 標(biāo)記6個(gè)離心管,分別為7,6,5,4,3,2。

3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液(用帶芯槍頭,下同)。

4. 在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對(duì)照,充分震蕩1分鐘,得1×10E7拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。

5. 換槍頭,在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。

6. 換槍頭,在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照到5號(hào)管中,充分震蕩1分鐘,得1×10E5拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。

7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

8. 如果有N個(gè)樣品,必須設(shè)置N+2個(gè)提取,多出的一個(gè)是PC(樣品制備陽性對(duì)照),一個(gè)是NC(樣品制備陰性對(duì)照)??梢杂?0μL上步制備的PCR陽性對(duì)照的第4號(hào)(濃度為1×10E4 拷貝/μL,10μL相當(dāng)于1萬拷貝)或第5號(hào)(濃度為1×10E5 拷貝/μL,10μL相當(dāng)于10萬拷貝)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品,則PC和NC的體積也必須是200μL。

9. 用自選方法純化樣品的DNA,本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。

三、設(shè)置qPCR反應(yīng)(20 μL體系,在樣品制備室進(jìn)行)

10. 如果只做1次重復(fù),則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管,其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品,1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照,6個(gè)用于PCR陽性對(duì)照。如果做2-3次重復(fù),則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。

11. 產(chǎn)品僅用于科研在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照,并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后加)

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